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    蛋白濃度測定的方法

    發布時間:2022-07-21      點擊次數:401
      蛋白濃度測定的方法:
     
      1. 紫外分光光度法
     
      紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法,不需要任何試劑,操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收,這是由于蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的,所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差,其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度,通過計算可得較為正確的蛋白質含量。
     
      2. 雙縮脲法
     
      利用半飽和硫酸銨或27.8%硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉淀下來,而此時血清白蛋白仍處于溶解狀態,因此可把兩者分開,這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用于臨床醫學,而且還廣泛地用于生物化學研究工作中,如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。
     
      蛋白質和雙縮脲一樣,在堿性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物(雙縮脲反應),且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比,因此可于蛋白質的定量測定。
     
      但必須注意,此反應并非蛋白質所特有,凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物,雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8%硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清,取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量,剩余部分則用濾紙過濾,使析出的球蛋白與白蛋白分離,取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量??偟鞍着c白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白/球比值。
     
      3. Folin-酚試劑法
     
      目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量,此法的特點是靈敏度高,較雙縮脲高兩個數量級,較紫外法略高,操作稍微麻煩,反應約在15分鐘有最大顯色,并最少可穩定幾個小時,其不足之處是干擾因素較多,有較多種類的物質都會影響測定結果的準確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸,可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物,顏色深淺與蛋白含量成正比。
     
      4. 考馬氏亮藍G-250
     
      此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高,可檢測到微量蛋白,操作簡便、快迅,試劑配制極簡單,重復性好,但干擾因素多??捡R氏亮藍G-250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色,當它通過疏水作用與蛋白質結合后,變成藍色,最大吸收波長從465nm轉移到595nm處,在一定的范圍內,蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比,測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。
     
      以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法,另外還有凱氏定氮法和BCA法,有凱氏定氮法結果精確,但操作復雜,BCA法又以其試劑穩定,抗干擾能力較強,結果穩定,靈敏度高而受到歡迎。
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